作為固著的生物，植物不能輕易地通過遷移來規(guī)避壓力源。為了評(píng)估所經(jīng)歷的非生物和生物脅迫的質(zhì)量和數(shù)量，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的信號(hào)通路。通常，屬于潛在病原體的分子在植物的質(zhì)膜水平上被識(shí)別。識(shí)別后，信號(hào)會(huì)從細(xì)胞外部傳遞到細(xì)胞中，如果可能的話，最終會(huì)引發(fā)防御反應(yīng) [1]。在病原體觸發(fā)免疫 (PTI) 中，一種基礎(chǔ)防御反應(yīng)，信號(hào)通常在二級(jí)信使 Ca 2+的幫助下傳遞。細(xì)胞外空間含有相對(duì)高濃度的Ca 2+，尤其是與細(xì)胞質(zhì)中的濃度并列時(shí)。為了對(duì)病原體的存在做出反應(yīng)，Ca 2+離子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄因子的幫助下改變細(xì)胞的行為[2]。這種 Ca 2+的輸入與 H +跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合發(fā)生 [3]。質(zhì)子的運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞外 pH 值的變化，這很容易量化。pH 值變化是評(píng)估植物是否發(fā)生 PTI 反應(yīng)的常用讀數(shù)。

為了快速連續(xù)篩選多種真菌代謝物的免疫活性，需要一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的系統(tǒng)來測(cè)量由 KIT 微結(jié)構(gòu)技術(shù)研究所 (IMT) 與 KIT 植物研究所合作開發(fā)的微流體生物反應(yīng)器 (MBR) 中的 pH 變化。因此，設(shè)計(jì)了從 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相應(yīng)的傳感器點(diǎn) SP-HP5 的可伸縮但可密封的連接器，并在機(jī)械和生物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了檢查。MBR 是一個(gè)兩室生物反應(yīng)器，用于培養(yǎng)植物細(xì)胞（見圖 1A）。可滲透膜將培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)流動(dòng)室隔開。它首先由 IMT [4] 的 Tim Finkbeiner 設(shè)計(jì)，然后進(jìn)一步發(fā)展。細(xì)胞可以通過橢圓形腔室兩端的兩個(gè)開口進(jìn)入培養(yǎng)腔室。開口配有 M5 螺紋，以便用合適的螺釘密封它們。MBR 可以通過單向流連接到更多的 MBR。因此，保留在培養(yǎng)室中的細(xì)胞不斷地被供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物。基本原理是通過每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持續(xù)供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物。基本原理是通過每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持續(xù)供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物。基本原理是通過每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值MBR 培養(yǎng)室中的煙草。可以將待評(píng)估免疫活性的物質(zhì)添加到提供給細(xì)胞的培養(yǎng)基中。如果可以觀察到 pH 值的增加，則可以將其解釋為目標(biāo)物質(zhì)具有免疫活性的第一個(gè)跡象。

材料與方法

連接設(shè)置和機(jī)械評(píng)估

連接的重要標(biāo)準(zhǔn)是密封生長(zhǎng)室，防漏但可拆卸，并提供簡(jiǎn)單直觀的操作。此外，我們的目標(biāo)是連接器的建筑高度較小，以使系統(tǒng)適合在顯微鏡下觀察。根據(jù)這些要求，制造了四種連接器設(shè)計(jì)。連接器在 MBR 及其性能中進(jìn)行了測(cè)試。光纖的四個(gè)連接器（見圖 2）由聚碳酸酯 (PC) 制成，因?yàn)檫@是 MBR 的外殼材料。兩個(gè)連接器設(shè)計(jì)有盲孔，而另外兩個(gè)連接器在之后鉆孔并密封。對(duì)于密封，測(cè)試了 PC 箔、簡(jiǎn)單膠帶和聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。該方法用于確定，如果由于鉆孔工具的劃痕而在盲鉆連接器中受到阻礙的透明度會(huì)影響測(cè)量的精度。此外，每種類型的一個(gè)連接器都配備了一個(gè)額外的凹槽，以便在發(fā)生泄漏時(shí)容納額外的密封環(huán)作為第二種選擇。首先，使用 Leitz Ergoplan 顯微鏡和 OceanInsight 的 Red Tide USB650 光纖光譜儀，通過測(cè)量和比較通過盲孔底部和密封箔的透射率來測(cè)試制造的連接器螺釘?shù)耐该鞫? 其次，對(duì)制造的連接器螺釘?shù)拿芊饽芰M(jìn)行了測(cè)試。使用經(jīng)過測(cè)試的連接器密封 MBR，并連接到注射泵（Harvard Apparatus PHD Ultra）。然后，去離子水 (DI-water) 以 2 mL/min 的穩(wěn)定流速泵入 MBR。測(cè)試持續(xù) 15 分鐘以確保密封*密封并保持干燥。在對(duì)連接器進(jìn)行泄漏測(cè)試后，將 pH-1 SMA HP5 連接到 MBR（圖 3 A）。將 pH 傳感器點(diǎn) (SP-HP5) 放置在連接器面向 MBR 內(nèi)部的一側(cè)，并將連接器擰入 MBR 的開口中。最后，將光纖放置在相應(yīng)的連接器中，并使用三種不同的 pH 緩沖溶液（pH 6.00、pH 7.413 和 pH 8.00，Carl Roth）一次一個(gè)泵送通過系統(tǒng)，以評(píng)估光纖的測(cè)量性能。傳感器連接器。將測(cè)量數(shù)據(jù)與使用 Mettler Toledo SevenCompact S220 作為外部 pH 傳感器的緩沖液測(cè)量值進(jìn)行比較。

細(xì)胞系和培養(yǎng)設(shè)置

對(duì)于 BY2 培養(yǎng)測(cè)試，使用普通煙草的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在 Murashige 和 Skoog 培養(yǎng)基 (MS) 中培養(yǎng)，含有 4.3 g/L Murashige-Skoog 鹽、30 g/L 蔗糖、200 mg/L KH2PO4、100 mg/L 肌醇、1 mg/L 硫胺素和 0.2 mg/ L 2,4-二氯苯氧乙酸。通過將 1.5 mL 的 7 天齡細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌錐形瓶中的 30 mL 新鮮 MS 中，每周對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行亞培養(yǎng)，并在 26°C 下在設(shè)置為 150 rpm 的軌道搖床上在黑暗中培養(yǎng)。為了在 MBR 內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，將 750 µL 7 天大的細(xì)胞懸液小心地移入 MBR 的培養(yǎng)室，并使用蠕動(dòng)泵提供新鮮的 MS 培養(yǎng)基（見圖 3B）。流動(dòng)被組織成通過芯片的單向循環(huán)流動(dòng)。蠕動(dòng)泵通過管道以 134 µL/min 的速度運(yùn)行。

殼聚糖引起的 pH 變化的測(cè)量

已知?dú)ぞ厶强稍谥参锛?xì)胞中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并相應(yīng)改變細(xì)胞外 pH 值。在這項(xiàng)工作中，在 MBR 中培養(yǎng)的 BY2 細(xì)胞用 25 µg/mL 殼聚糖（Sigma Aldrich Chemie GmbH，德國(guó)）和相應(yīng)的 0.0025% 乙酸溶劑對(duì)照進(jìn)行處理。首先，該裝置安裝在如上所述的潔凈工作臺(tái)中，管道以圓形方式連接 MBR、泵和 MS 介質(zhì)容器。然后以 134 µL/min 的速度將 MS 介質(zhì)泵入系統(tǒng)并在第一次到達(dá) MBR 時(shí)停止。將 750 µL 7 天大的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞室中。啟動(dòng)泵，芯片在充滿 MS 的同時(shí)直立，以促進(jìn)剩余氣泡的排出。一旦 MS 介質(zhì)開始從芯片的出口流出，芯片就被安裝到支架中并最終水平放置。在開始 pH 測(cè)量之前，將芯片內(nèi)的傳感器平衡 90 分鐘。隨后，測(cè)量 pH 值 30 分鐘以計(jì)算基線 pH。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測(cè)量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對(duì)于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測(cè)量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對(duì)于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測(cè)量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對(duì)于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。

結(jié)果與討論

機(jī)械結(jié)果

帶有用于光纖的鉆孔開口的兩種連接器設(shè)計(jì)覆蓋有 PC 箔、PDMS 和 3M 聚酯膠帶 851（“綠色膠帶"），以在培養(yǎng)室和光纖之間形成防漏邊界MBR外的光纖。在我們的實(shí)驗(yàn)中，PC 箔無法充分粘合，但 3M 聚酯膠帶 851 充分密封了連接器插頭。然而，由于膠帶的綠色和低透光率，這種膠帶密封連接器不能用于 pH 測(cè)量。PDMS 密封的鉆孔也密封不漏。此外，盲鉆連接器都充分密封了 MBR。與沒有這些的連接器相比，在密封系統(tǒng)方面沒有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括額外的凹槽和額外的密封環(huán)。

關(guān)于透明度，PDMS 密封連接器顯示出低的傳輸率，而 PC 箔密封連接器傳輸了大約 95% 的光（見圖 4）。然而，PDMS 的低傳輸可能是由于測(cè)量設(shè)置問題造成的。

接下來，測(cè)試連接器傳感器設(shè)置的 pH 測(cè)量精度。由于制造商的 pH 緩沖值與 S220 傳感器相比是準(zhǔn)確的，因此將測(cè)量值與作為參考的給定值進(jìn)行了比較。MBR 中相關(guān)緩沖液的 pH 值以各自的流速測(cè)量 3 次，持續(xù) 10 分鐘（流速為 0 mL/min 和 2 mL/min）和 45 分鐘（流速為 0.2 mL/min） . 箱線圖是為三個(gè)測(cè)量的組合數(shù)據(jù)庫生成的（圖 5）。確定與給定緩沖值的絕對(duì)偏差。對(duì)于所有三個(gè) pH 值的所有三個(gè)條件，四分位數(shù)范圍都很小，介于 0.014 pH 到 0.005 pH 之間。除了沒有流動(dòng)循環(huán)的 6-pH 緩沖液中的 pH 值評(píng)估之外，中值和平均值幾乎相同。因此，

圖 5：使用不帶密封環(huán)凹槽的盲孔連接器，使用 pH-1 SMA HP5 測(cè)量的 pH 值與緩沖液設(shè)定值的絕對(duì)偏差。A) 緩沖液：6 pH，B) 緩沖液：7.429 pH，C) 緩沖液：8 pH。

但是，如果將不同的連接器與作為參考系統(tǒng)的玻璃燒杯中的測(cè)量值進(jìn)行比較，則 MBR 中的測(cè)量值顯示相同緩沖液的測(cè)量值明顯高于燒杯中的測(cè)量值（圖 6）。這可能是因?yàn)閭鞲衅魇菫椴ＡХ磻?yīng)器設(shè)計(jì)的，而不是通過聚合物進(jìn)行測(cè)量。因?yàn)椴荒芨鶕?jù)不同的測(cè)量光透射率從使用不同的連接器中導(dǎo)出圖案，所以假設(shè)不同連接器的不同透明度不是測(cè)量中偏移的主要原因。

結(jié)論

根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和不同設(shè)計(jì)，我們得出結(jié)論，通過不同連接器設(shè)計(jì)的光傳輸似乎不會(huì)顯著影響測(cè)量。然而，與通過玻璃燒杯的參考測(cè)量值相比，聚合物連接器的測(cè)量 pH 值似乎發(fā)生了變化。由于玻璃是傳感器指南中規(guī)定的適當(dāng)反應(yīng)器材料，因此可能需要進(jìn)行特殊校準(zhǔn)以應(yīng)對(duì)玻璃中的光折射，從而在使用聚合物時(shí)導(dǎo)致測(cè)量值發(fā)生變化。如果這種轉(zhuǎn)變可以得到驗(yàn)證——可能通過更多和不同的設(shè)置測(cè)試——并且具有相應(yīng)斑點(diǎn)的 pH-1 SMA HP5 傳感器將適用于測(cè)量我們 MBR 中的 pH 值。

在之前的實(shí)驗(yàn)中，我們通過使用使用電極的臺(tái)式 pH 計(jì)測(cè)量 pH 值，證實(shí) 25 µg/mL 的殼聚糖會(huì)導(dǎo)致 BY2 細(xì)胞的細(xì)胞外 pH 值升高。使用相同的處理，這項(xiàng)工作旨在證明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系統(tǒng)的組合可用于觀察與免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞外 pH 值增加。開始處理后，15 分鐘后可觀察到 pH 值顯著增加（見圖 7）。這種延遲可以通過需要將處理過的 MS 泵入 MBR 的時(shí)間來解釋。觀察到的 pH 變化表明該方法可用于篩選植物細(xì)胞上物質(zhì)的免疫活性。通過使用多個(gè)通道和傳感器點(diǎn)，將有可能建立一種高通量篩選方法。此外，我們調(diào)查了 MBR 培養(yǎng)室由于培養(yǎng)室的橢圓形狀而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)梯度的發(fā)展。關(guān)于這個(gè)評(píng)估，更大范圍內(nèi)的 pH 值分析，例如，使用 VisiSens 系統(tǒng)，將是有趣的。然而，傳感器箔必須被穿孔以使?fàn)I養(yǎng)流到達(dá)培養(yǎng)室，并且必須建立傳感器箔的安裝過程。